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Oct 11, 2023

El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) modula el metabolismo de los lípidos en el camarón blanco

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 546 (2023) Citar este artículo

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Además del efecto Warburg, que aumenta la disponibilidad de energía y bloques de construcción biosintéticos en los camarones infectados con WSSV, WSSV también induce la lipólisis en la etapa de replicación del genoma viral (12 hpi) para proporcionar material y energía para la replicación del virus y la lipogénesis. en la etapa viral tardía (24 hpi) para completar la morfogénesis del virus mediante el suministro de especies particulares de ácidos grasos de cadena larga (LCFA). Aquí, mostramos además que WSSV causa una reducción en las gotas de lípidos (LD) en los hemocitos en la etapa de replicación del genoma viral y un aumento en los LD en los núcleos de los hemocitos infectados con WSSV en la etapa tardía viral. En el hepatopáncreas, la infección por WSSV desencadena la lipólisis, lo que conduce a la liberación de ácidos grasos en la hemolinfa. El experimento de inhibición de la β-oxidación revela que los ácidos grasos generados por la lipólisis inducida por WSSV pueden desviarse hacia la β-oxidación para la producción de energía. En la etapa tardía viral, la infección por WSSV conduce a la lipogénesis tanto en el estómago como en el hepatopáncreas, lo que sugiere que los ácidos grasos tienen una gran demanda en esta etapa para la morfogénesis del virión. Nuestros resultados demuestran que WSSV modula el metabolismo de los lípidos específicamente en diferentes etapas para facilitar su replicación.

Al inducir la reprogramación metabólica, las células cancerosas pueden satisfacer su demanda de intermediarios metabólicos y energía1,2,3. Posteriormente, para facilitar el rápido crecimiento y proliferación de las células cancerosas, se generan biomoléculas como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos4. Una parte importante de esta reprogramación metabólica es la alteración del metabolismo de los lípidos que se observa en muchos tipos diferentes de células cancerosas5,6. Los lípidos son versátiles y en las células cancerosas pueden desempeñar varias funciones. Así, por ejemplo, los ácidos grasos (FA) de las células cancerosas se pueden utilizar para construir una membrana biológica durante la proliferación de células cancerosas7,8. Las enzimas involucradas en la oxidación de ácidos grasos (FAO) también se sobreexpresan a menudo en las células cancerosas para adaptarse a la producción de energía y NADPH9,10. La modificación de proteínas por fracciones lipídicas también está asociada con el metabolismo del cáncer11,12.

Como los lípidos están muy involucrados en muchos procesos biológicos en una célula cancerosa, también participan en los diversos mecanismos de replicación viral, que van desde la entrada hasta la liberación13,14. Se ha encontrado reprogramación metabólica de lípidos en varios virus que desencadenan el efecto Warburg: herpesvirus del sarcoma de Kaposi (KSHV)15, virus de la hepatitis C (HCV)16 y virus del papiloma humano (HPV)17. Al cambiar el perfil lipídico del huésped, el virus del dengue (DENV) induce la alteración de la membrana, lo que promueve la replicación viral y protege al virus de los mecanismos de defensa antivirales18. DENV también utiliza la proteína de gotas de lípidos AUP1 para iniciar la lipofagia, que a su vez genera fosfolípidos para facilitar la replicación del virus19. Una proteína del tegumento del KSHV se dirige a las balsas de lípidos de la membrana de la célula huésped para facilitar la liberación de partículas virales20, mientras que una proteína del VHC llamada NS5A contribuye al aumento del tamaño de las gotitas de lípidos y promueve el proceso de morfogénesis del VHC21. Mientras tanto, en los virus envueltos, es común que los lípidos de la membrana de la célula huésped se adapten para usarse como la cubierta exterior del virus22. Todos estos ejemplos demuestran cómo se requiere la modificación o alteración del metabolismo de los lípidos por parte de un virus para facilitar la producción de partículas de virión infecciosas.

En línea con otros virus, se ha demostrado que un virus mortal del camarón llamado virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) cambia la población y la composición de varias especies de ácidos grasos durante la infección: en la etapa de replicación del genoma viral (12 hpi), el WSSV induce la lipólisis, en el que los ácidos grasos se someten a β-oxidación para generar energía y biomoléculas, mientras que en la etapa tardía (24 hpi), WSSV mejora la expresión de ácido graso sintasa (FAS) para apoyar la lipogénesis, lo que resulta en la producción de grandes cantidades de ácido graso para la morfogénesis del virión23. En el presente estudio, investigamos más a fondo los mecanismos detrás de estos cambios en el metabolismo de los lípidos en los camarones infectados con WSSV. Primero utilizamos tinción fluorescente para investigar la localización de gotitas de lípidos en hemocitos infectados en diferentes etapas de la replicación del virus. Luego, medimos la actividad de la lipasa, una enzima clave en la lipólisis, y monitoreamos su efecto sobre la cantidad de ácidos grasos en el tejido del camarón. Para investigar cómo la β-oxidación afecta la producción de energía y la morfogénesis del virión, luego usamos Etomoxir, un inhibidor de CPT1, para bloquear la β-oxidación en camarones infectados con WSSV. Finalmente, bloqueamos tanto la β-oxidación como la síntesis de ácidos grasos en camarones infectados y observamos cómo esto afecta las especies de ácidos grasos de cadena larga (LCFA) en el tejido de los camarones.

Anteriormente mostramos que WSSV altera la variedad de ácidos grasos de cadena larga durante la infección23. Aquí, para comprender mejor la dinámica de la acumulación de lípidos en los camarones infectados con WSSV, utilizamos la tinción BODIPY 493/503 para monitorear los cambios en la cantidad de gotas de lípidos, su distribución celular y el tamaño de las gotas a las 12 y 24 hpi (Fig. .1a). En la etapa de replicación del genoma viral (12 hpi), menos células en el grupo infectado con WSSV contenían gotitas de lípidos (LD) en comparación con los controles de PBS (Fig. 1bi), lo que sugiere la aparición de lipólisis en esta etapa. Por el contrario, en la etapa tardía viral (24 hpi), la cantidad de hemocitos que albergaban LD aumentó significativamente en el grupo de infección por WSSV, y cada hemocito con LD también contenía más puntos LD (Fig. 1bi, ii). WSSV no afectó la cantidad de hemocitos que albergaban LD citoplasmáticos en ninguna de las etapas (Fig. 1biii), pero en la última etapa, los camarones infectados con WSSV tenían más hemocitos con LD en el núcleo (Fig. 1biv). WSSV también aumentó el número de LD citoplásmicos y nucleares en la etapa tardía (Fig. 1bv, vi). El mayor número de LD en los hemocitos del grupo infectado con WSSV sugirió que WSSV podría desencadenar la lipogénesis en la etapa tardía.

a Los hemocitos recolectados de camarones infectados con WSSV y camarones inyectados con PBS (control) a las 12 hpi y 24 hpi se tiñeron con DAPI, azul de Evan y BODIPY para visualizar el núcleo, el citoplasma y las gotitas de lípidos (LD), respectivamente. La barra de escala representa 10 μm. b Se utilizaron varias métricas para cuantificar los LD: [i] Porcentaje de celdas con LD detectados; [ii] Número de LDs puncta por celda con LDs; [iii] Porcentaje de células con LD citoplasmáticas/total de células con LD; [iv] Porcentaje de células con LD nucleares/total de células con LD; Número de puntos LD presentes en el citoplasma [v] y el núcleo [vi] por hemocito que alberga LD; Diámetro máximo de LD en [vii] citoplasma y [viii] núcleo; Área positiva de LDs en [ix] citoplasma y [x] núcleo. Los resultados se expresaron como la media (n > 3) de la proporción de células permeabilizadas en relación con el número total del tipo de célula denominador especificado (n > 100). Cada barra representa la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

En el grupo WSSV, el diámetro y el área transversal total de los LD citoplásmicos aumentaron significativamente en la etapa de replicación del genoma viral y disminuyeron en la etapa tardía viral (Fig. 1bvii, ix). Sin embargo, estos cambios no se observaron en los LD nucleares (Fig. 1bviii, x).

Examinamos la actividad de la lipasa en tres tejidos diferentes de camarones infectados con WSSV. En la etapa de replicación del genoma viral, no se observaron diferencias en la actividad de la lipasa entre los grupos PBS y WSSV en los hemocitos o el estómago, pero la actividad de la lipasa se elevó en el hepatopáncreas infectado con WSSV (Fig. 2a). En la etapa tardía, la actividad de la lipasa no cambió en todos los tejidos infectados con WSSV (Fig. 2b). Los FFA, que son producidos por la actividad de la lipasa, también se detectaron en niveles más altos en hemocitos y hemolinfa infectados con WSSV en la etapa de replicación del genoma viral (Fig. 2c). Esto podría deberse a la elevada actividad de la lipasa en el hepatopáncreas. Por el contrario, los FFA disminuyeron significativamente en el hepatopáncreas infectado con WSSV en la etapa tardía viral (Fig. 2c), lo que podría ser una consecuencia del agotamiento de los lípidos durante la etapa de replicación del genoma viral.

Los tejidos indicados de camarones inyectados con PBS y WSSV se recolectaron a las 12 hpi y 24 hpi y se sometieron a a, medición de la actividad de la lipasa b y (c) cuantificación de ácidos grasos libres. La actividad de la lipasa aumentó en el hepatopáncreas infectado a las 12 hpi. Los ácidos grasos libres aumentaron en los hemocitos y la hemolinfa a las 12 hpi, mientras que se encontró una disminución significativa de los ácidos grasos libres en el hepatopáncreas infectado a las 24 hpi. Cada barra representa la media ± SD, n = 2 ~ 3 muestras de piscina (3 camarones por piscina). Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01). Hcy hemocitos, Hly hemolinfa, Stm estómago, Hep hepatopáncreas.

En circunstancias normales, las gotitas de lípidos y los triglicéridos son los sustratos de la lipasa y pueden degradarse en FFA que luego se transportan a la mitocondria y se utilizan para producir energía mediante la β-oxidación24,25. Aquí, tratamos a los camarones con Etomoxir, un inhibidor específico de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT1), para bloquear la entrada de los LCFA en las mitocondrias, inhibiendo así la β-oxidación. Cuando se inhibió la β-oxidación, encontramos que la actividad mitocondrial (representada por la relación ATP/ADP) en los hemocitos infectados con WSSV disminuyó significativamente en la etapa de replicación del genoma viral pero aumentó en la etapa tardía (Fig. 3a). Para determinar si la β-oxidación también es importante para la producción de viriones, a continuación medimos el número de copias del genoma viral en hemocitos y hemolinfa. En los hemocitos, el número de copias del genoma viral en el grupo solvente aumentó en la etapa tardía viral en comparación con la etapa de replicación del genoma viral, mientras que la inhibición de la β-oxidación condujo a un número de copias del genoma viral aún mayor en la etapa tardía (Fig. 3b). De manera similar, en la hemolinfa, la inhibición de la β-oxidación resultó en un aumento significativo del número de copias del genoma viral en la etapa tardía (Fig. S1). Estos resultados muestran que la inhibición de la β-oxidación conduce consistentemente a un aumento en los ADN genómicos virales tanto en los hemocitos como en la hemolinfa, y sugieren que la β-oxidación puede estar involucrada en la replicación del WSSV.

A los camarones se les inyectó Etomoxir 10 h después del desafío con WSSV. a Los hemocitos de 12 hpi y 24 hpi se sometieron a un ensayo de relación ATP/ADP. Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01). b Se usaron hemocitos de ambos puntos de tiempo después del desafío con WSSV para cuantificar el número de copias del genoma viral para evaluar la replicación del ADN viral. Cada barra representa la media ± SD, n = 3–4 muestras de piscina (4 camarones por piscina). Los asteriscos indican diferencias entre los grupos de WSSV (*p < 0,05, **p < 0,01). Solv. solvente, Eto etomoxir, hemocitos Hcy.

La lipasa se activó en el hepatopáncreas en la etapa de replicación del genoma viral (Fig. 2a), y planteamos la hipótesis de que los LCFA producidos por la actividad de la lipasa podrían cambiar a la oxidación β. Esto también sería consistente con Hsieh et al.23, quienes informaron que varios LCFA se redujeron en el estómago infectado en la misma etapa. Por lo tanto, procedimos a cuantificar la cantidad de varios LCFA en el hepatopáncreas en condiciones de inhibición de la β-oxidación. En la etapa de replicación del genoma viral, el ácido palmítico (C16:0), uno de los ácidos grasos saturados más comunes que se encuentran en los animales, disminuyó significativamente por la infección por WSSV (grupo WSSV/PBS) en comparación con el control PBS (grupo PBS/PBS) , pero aumentó significativamente cuando se bloqueó la β-oxidación (grupo WSSV / Eto) (Fig. 4a). También se observaron resultados similares en otros LCFA como C18: 0, C20: 1 y C20: 2 (Fig. 4a), lo que sugiere que, como se esperaba, el bloqueo de la oxidación β impidió un mayor procesamiento metabólico de los LCFA inducidos por WSSV. En la etapa viral tardía, cuando la lipólisis ya no estaba activada (Hsieh et al.23), la inhibición de la β-oxidación no tuvo un efecto significativo (Fig. 4b). Esto es consistente con la idea de que la energía producida por la β-oxidación no se requiere en esta etapa (Fig. 3a).

Se recogieron muestras de hepatopáncreas de los grupos infectados con WSSV y de los grupos de control con PBS a las 12 y 24 hpi. Los grupos infectados con WSSV se designaron como WSSV/PBS y WSSV/Eto según si los camarones infectados con WSSV fueron tratados con PBS o Etomoxir. Asimismo, los grupos de control de PBS se denominaron PBS/PBS y PBS/Eto. Los perfiles de LCFA de a 12 yb 24 hpi se determinaron mediante espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC/MS). La inhibición de la β-oxidación interrumpió el consumo de LCFA inducido por WSSV a las 12 hpi. Cada barra representa la media ± SD, n = 2 muestras de piscina (3 camarones por piscina). Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

Hsieh et al.23 demostraron la participación de FAS en la replicación de WSSV: 1. WSSV indujo la expresión de FAS a través de la vía de señalización PI3K-Akt-mTOR-HIF1α; 2. FAS fue crucial para la morfogénesis del virión. Para caracterizar el papel de FAS en la generación de LCFA, 4 h después de la inyección con WSSV, los camarones expuestos al virus se inyectaron por vía intramuscular con el inhibidor de FAS C75 y los LCFA se cuantificaron posteriormente en el estómago y el hepatopáncreas. En el estómago en la etapa de replicación del genoma viral, la infección por WSSV (grupo WSSV/PBS) disminuyó varios LCFA; sin embargo, con la excepción de unos pocos LCFA, cuando también se inhibió FAS (grupo WSSV/C75), entonces se redujo la magnitud de estas disminuciones (Fig. 5a). En la última etapa, varios LCFA, incluidos C16:0, C18:1n-9c, C18:1n-9t y C20:5n-3, aumentaron debido a la infección por WSSV (grupo WSSV/PBS), lo que sugiere que se indujo la lipogénesis ( Figura 5b). Sin embargo, la inhibición de FAS interrumpió la generación de LCFA en camarones infectados con WSSV (grupo WSSV/C75) (Fig. 5b).

Se inyectó C75 en los camarones 4 h después de la inyección de WSSV para inhibir FAS. Los grupos infectados con WSSV se designaron como WSSV/PBS y WSSV/C75 para indicar que a los camarones infectados con WSSV se les inyectó PBS o C75. Los grupos de control de PBS se denominaron PBS/PBS y PBS/C75. Se empleó espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC/MS) para investigar el perfil de LCFA en el estómago infectado con WSSV a 12 hpi y b 24 hpi. La inhibición de FAS redujo la producción de LCFA en la última etapa de la infección. Cada barra representa la media ± SD, n = 2–4 muestras de piscina (3 camarones por piscina). Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

Como se muestra en la Fig. 6a, WSSV también redujo el ácido palmítico y el ácido esteárico (C18:0) en el hepatopáncreas infectado en la etapa de replicación del genoma viral (grupo WSSV/PBS), pero esta reducción fue cancelada por la inhibición de FAS (grupo WSSV/C75). ). En la etapa tardía, varios LCFA aumentaron en el hepatopáncreas infectado (grupo WSSV/PBS), mientras que la inhibición de FAS no tuvo un efecto significativo (grupo WSSV/C75) (Fig. 6b). Estos resultados son consistentes con el informe de Hsieh et al.23, en el que se desencadenó la lipólisis en la etapa de replicación del genoma viral y la lipogénesis en la etapa tardía, y en conjunto confirman que WSSV redirige el metabolismo de los lípidos en los camarones infectados con WSSV.

Se empleó espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC/MS) para investigar el hepatopáncreas infectado con WSSV inhibido por FAS a las 12 y b 24 hpi. Los grupos infectados con WSSV se designaron como WSSV/PBS y WSSV/C75 para indicar que a los camarones infectados con WSSV se les inyectó PBS o C75. Los grupos de control de PBS se denominaron PBS/PBS y PBS/C75. A diferencia del estómago (Fig. 5b), la inhibición de FAS no tuvo efecto sobre la producción de LCFA en el hepatopáncreas en la etapa tardía. Cada barra representa la media ± SD, n = 2–4 muestras de piscina (3 camarones por piscina). Los asteriscos indican diferencias entre los grupos WSSV y PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

La reprogramación metabólica de los lípidos se encuentra no solo en las células cancerosas y en las células infectadas por virus de vertebrados26,27,28, sino también en las células de invertebrados infectadas por virus18. Nuestros resultados actuales, que incluyen nuevos datos sobre los ácidos grasos no unidos, ahora brindan más detalles sobre cómo se desvía el metabolismo de los lípidos en los camarones infectados con WSSV. Un estudio anterior23, que encontró que la lipólisis se induce en la etapa de replicación del genoma viral, mientras que la lipogénesis se induce en la última etapa de la replicación del virus, también informó que estos cambios metabólicos se caracterizan por cambios en los perfiles de los LCFA, con varios LCFA disminuidos. en la etapa de replicación del genoma viral. Nuestros resultados actuales de tinción de LD muestran además que hay una reducción en los LD, especialmente los LD citoplasmáticos, en la etapa de replicación del genoma viral (Fig. 1bi, v), lo que proporciona más evidencia de que la lipólisis está ocurriendo en esta etapa. Los FFA liberados por este proceso luego sirven como fuente para la producción de energía a través de la β-oxidación (Fig. 3a). Los ácidos grasos se utilizan de manera similar en una línea celular humana infectada por el virus del dengue (DENV), donde los LD se transportan a los lisosomas y los ácidos grasos liberados luego se someten a β-oxidación para generar ATP para la replicación del virus29. En cuanto a la conexión entre la β-oxidación y la morfogénesis del virión (Figs. 3b y S1), planteamos la hipótesis de que el consumo de ácidos grasos a través de la β-oxidación también genera el material necesario para la lipogénesis y la morfogénesis del virión que se produce en la etapa tardía de la infección viral. replicación. En apoyo de esto, notamos que el número de especies de hidrocarburo y colesterol es mayor en el virión WSSV en comparación con los núcleos de la célula huésped30, y que el enterovirus redistribuye los ácidos grasos del huésped a sus compartimentos de replicación a través de la lipólisis31, ambas observaciones son consistentes con la idea de que el ácido graso consumido podría reutilizarse para la producción de lípidos específicos como el colesterol. Sin embargo, también notamos que la inhibición de la β-oxidación condujo a un aumento en el ADN viral tanto dentro de los hemocitos (Fig. 3b) como en la hemolinfa (Fig. S1), lo cual es difícil de explicar si la β-oxidación realmente está impulsando la morfogénesis del virión. . Por otro lado, dado que nuestro método para contar el número de copias de viriones detectaría igualmente bien tanto viriones completos como incompletos, también es posible que la inhibición de la β-oxidación pueda estar interrumpiendo el proceso de morfogénesis del virión de una manera que provoque grandes cantidades de viriones anormales. y/o ADN viral desnudo para ser liberado en la hemolinfa. Claramente, estas posibilidades deberán explorarse más experimentalmente utilizando una técnica como el rastreo de isótopos.

La acumulación de LD, que se observa en células infectadas con VHC y SARS-CoV-232,33, también se observó en los hemocitos infectados con WSSV en la etapa tardía de la infección por el virus (Fig. 1bi, ii), además de ser informado por Hsieh et al.23. Aquí, la mayoría de las LD se localizaron en los núcleos de los hemocitos infectados (Fig. 1biv, vi), que es donde ocurre la morfogénesis del virión34,35. Las imágenes Raman también mostraron que el contenido de lípidos aumentó notablemente en el núcleo de los hemocitos infectados [a 60 hpi] (Fig. S2). Hasta la fecha, no está claro cómo WSSV podría aprovechar las LD acumuladas localizadas en el núcleo de los hemocitos, pero especulamos que podrían proporcionar una reserva de componentes del virus para usar en la morfogénesis del virión, como lo hacen con el virus de la hepatitis C, donde el núcleo de la nucleocápsida del VHC y la proteína reguladora NS5A se translocan desde el retículo endoplásmico (ER) a las LD, que luego actúan como un sitio para el ensamblaje del virión36. Además, las LD nucleares acumuladas en las células de vertebrados pueden estar involucradas en la regulación de la expresión génica que facilita la morfogénesis viral en la etapa tardía viral37. Por lo tanto, las LD podrían tener dos destinos en el curso de una infección por WSSV: 1. en la etapa de replicación del genoma viral, las LD se descomponen para producir energía y, posiblemente, proporcionar material para la morfogénesis del virión; 2. en la etapa viral tardía, las LD se acumulan en el núcleo para apoyar la morfogénesis del virión.

Como parásito obligado, los virus obtienen energía (en forma de ATP) de los huéspedes celulares para su replicación38. Los resultados de la relación ATP/ADP que se muestran en la Fig. 3a muestran que WSSV elevó el ATP en el grupo solvente en ambas etapas (control PBS frente a WSSV a las 12 y 24 hpi). Resultados similares fueron informados por Apún-Molina et al.39, donde se observó una mayor carga de energía adenílica (AEC) en el hepatopáncreas infectado con WSSV a las 24 hpi. Esta elevación de ATP es consistente con investigaciones previas, que encontraron que WSSV requiere energía para facilitar su replicación39,40,41. Como se discutió anteriormente, la β-oxidación podría proporcionar ATP para la replicación del virus en la etapa de replicación del genoma viral. Sorprendentemente, sin embargo, a las 24 hpi, la inhibición de la β-oxidación resultó en niveles elevados de ATP independientemente del estado de infección (Fig. 3a, grupo Disolvente frente al grupo Etomoxir a las 24 hpi). Especulamos que la larga duración de la inhibición de la β-oxidación podría haber llevado a la activación de otras vías de energía para mantener la viabilidad celular.

La Figura 2a muestra que la actividad de la lipasa se desencadenó en el hepatopáncreas de los camarones, que es un tejido que almacena lípidos. A diferencia de los ácidos grasos totales, que Hsieh et al.23 encontraron disminuidos en el estómago a las 12 hpi y aumentados a las 24 hpi, lo que encontramos aquí sugiere que a las 12 hpi, los AGL podrían haberse liberado del hepatopáncreas a la hemolinfa y luego tomado por los hemocitos (Fig. 2c). Observamos que la absorción de FA también es promovida por otros virus con fines de replicación42,43,44. Posteriormente, la reducción sustancial de los ácidos grasos libres en el hepatopáncreas en la etapa tardía viral (Fig. 2c) sugiere que el hepatopáncreas puede actuar como una fuente de ácidos grasos durante la infección por el virus. Además, observamos que varios LCFA se redujeron en el hepatopáncreas infectado con WSSV en la etapa de replicación del genoma viral (Fig. 4a), pero que cuando se inhibió la β-oxidación, este consumo de LCFA inducido por WSSV ya no se observó (Fig. 4a). Estos resultados sugieren que los lípidos almacenados en el hepatopáncreas se descomponen a través de la lipólisis en la etapa de replicación del genoma viral, y que los ácidos grasos producidos por este proceso luego se someten a β-oxidación o se liberan directamente en la hemolinfa para alimentar el WSSV infectado. hemocitos Por el contrario, en la etapa tardía viral, la inhibición de la β-oxidación no supuso una diferencia significativa en la disponibilidad de los LCFA (Fig. 4b), lo que sugiere que en este momento, como proponen Hsieh et al.23, la reprogramación de lípidos inducida por WSSV se alejó de la lipólisis y se acercó a la lipogénesis.

FAS, una enzima importante en la lipogénesis, se activa en las células tumorales para mantener la proliferación y en las células infectadas por virus para la morfogénesis del virión45,46,47. Previamente encontramos que la inhibición de FAS afecta la morfogénesis del virión pero no la expresión de la proteína viral23. Aquí encontramos además que el estado energético de los hemocitos infectados con WSSV no se vio interrumpido por la inhibición de FAS (Fig. S3). Todos estos resultados implican que FAS produce FA únicamente para usarse en la morfogénesis del virus. Como era de esperar, en la etapa tardía viral, la inhibición de FAS obstaculizó la lipogénesis inducida por WSSV en el estómago infectado (Fig. 5b); sin embargo, este efecto no se observó en el hepatopáncreas, excepto en el ácido oleico (C18:1n-9c) (Fig. 6b). Sorprendentemente, la inhibición de FAS también retrasó el consumo de algunos de los LCFA tanto en el estómago como en el hepatopáncreas infectados con WSSV (Figs. 5a y 6a).

En conjunto, estos resultados muestran cómo el WSSV puede modular el metabolismo de los lípidos del huésped para establecer un entorno favorable para su replicación: el WSSV desencadena la lipólisis o la lipogénesis según si el virus está utilizando los ácidos grasos como fuente de energía o como material para la morfogénesis del virus. Este es el mismo tipo de reprogramación de lípidos que se observa con algunos Flavivirus48,49,50. Para desarrollar una estrategia antiviral efectiva, será importante dilucidar más las vías de señalización y las proteínas virales que respaldan estos mecanismos. Si bien hemos demostrado previamente que WSSV induce la expresión de FAS a través de la vía PI3K-Akt-mTOR-HIF1α23, también podrían estar involucradas otras vías de señalización. También será interesante investigar cómo WSSV puede regular el cambio de lipólisis a lipogénesis en un momento específico después de la infección.

El camarón blanco (Litopenaeus vannamei; 3 g de peso corporal) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro de Animales Acuáticos de la Universidad Nacional del Océano de Taiwán, el Centro Internacional para el Desarrollo Científico de la Acuicultura del Camarón, la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU) y el Departamento de Acuicultura, Universidad Nacional de Ciencia y Tecnología de Pingtung (NPUST). Los camarones se cultivaron en sistemas de tanques que contenían agua de mar esterilizada (30 ppt; 25–27 °C) durante 1–2 días antes de los experimentos. La reserva de virus para el inóculo experimental se obtuvo mediante la recolección de hemolinfa de camarones SPF (libres de patógenos específicos) moribundos infectados con el aislado WSSV de Taiwán (n.º de acceso de GenBank AF440570) y luego se diluyeron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 KCl mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM). La reserva de virus se almacenó a -80 °C y el inóculo experimental se preparó a partir de la reserva por dilución (10–4) con PBS. Los camarones se expusieron mediante inyección intramuscular con inóculo de WSSV (100 µl/camarón). Este título de desafío dio como resultado una mortalidad acumulada inducida por WSSV del 50 % a las 72 hpi.

A las 12 y 24 h después de la inyección del virus, la hemolinfa de 3 ~ 6 camarones del grupo inyectado con WSSV y PBS se recolectó individualmente con un volumen igual de solución anticoagulante (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA, 10 Tris-HCl mM, pH 7,5). A continuación, cada muestra de hemocitos se sembró en un cubreobjetos por duplicado con medio 15 de Leibovitz 2x (Invitrogen; con FBS al 10 %, glucosa al 1 %, NaCl al 0,005 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml, estreptomicina 1,25 g/ ml fungizona). Después de incubar durante 20 min a temperatura ambiente, los hemocitos se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BODIPY 493/503 (Invitrogen) a una concentración de trabajo de 0,1 mg/mL durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente para teñir el neutro. gotitas de lípidos. Luego, los hemocitos se lavaron 3 veces más con PBS antes de fijarlos con formaldehído al 4% en hielo. A continuación, las células se tiñeron durante 3 min con DAPI a una concentración de trabajo de 1,5 × 10−5 µg/ml (diclorhidrato de 4′-6-diamidino-2-fenilindol; Vector Laboratories Inc.) para contrateñir los núcleos. Después de lavar otras 3 veces con PBS, los hemocitos se incubaron con azul de Evans (0,2 μg/ml) durante 1 minuto para contrateñir el citoplasma. Finalmente, las células de los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de microscopio y se investigó la fluorescencia usando un microscopio de fluorescencia.

Después de teñir los LD en los hemocitos de camarones infectados con WSSV primarios como se describe anteriormente, se seleccionaron aleatoriamente varios campos de cada portaobjetos para la captura de imágenes y el análisis posterior. Para cada camarón, se investigaron al menos 100 células. En este estudio se utilizaron varias métricas para evaluar la dinámica de las gotitas de lípidos en los hemocitos de los camarones: (i) Células con LD/células totales (%); (ii) número de puntos LD en celdas con LD; (iii) células con LD citoplasmáticas/total de células con LD (%); (iv) células con LD nucleares/total de células con LD (%); (v) número de puntos LD citoplásmicos por célula con LD; (vi) número de puntos LD nucleares por celda con LD; (vii) diámetro máximo de las LD citoplasmáticas; (viii) diámetro máximo de los LD nucleares; (ix) área transversal total (µm2) de las LD en el citoplasma; (x) área transversal total (µm2) de los LD en el núcleo. A continuación, los datos se sometieron al análisis estadístico que se describe a continuación.

Se recogieron muestras agrupadas de hemocitos, estómago y hepatopáncreas de camarones a las 12 y 24 h después de la inyección de WSSV (3 camarones/grupo y 4 grupos/grupo) y se midió la actividad de la lipasa utilizando un kit comercial (Lipase Activity Fluorometric Assay Kit III; BioVision Inc. .). Las muestras se homogeneizaron en 100 µl (hemocitos) o 200 µl (estómago y hepatopáncreas) de tampón de ensayo de lipasa enfriado con hielo y se centrifugaron para eliminar los restos celulares. Los lisados ​​resultantes (50 μl/pocillo) se transfirieron a una placa de 96 pozos y se agregaron 50 μl de la mezcla de reacción (48 μl de tampón de ensayo y 2 μl de sustrato de lipasa) a cada pozo. Después de la incubación a 37 °C durante 30 min (T1), se midió la absorbancia de cada muestra a Ex/Em = 529/600 nm para obtener el valor A1. Después de incubar durante otros 30 min (T2), se midió nuevamente la absorbancia de cada muestra para obtener el valor A2. Se generó una curva estándar de metilresorufina a partir de una serie de concentraciones que oscilaban entre 0 y 100 pmol/pocillo y se usó para convertir la diferencia de absorbancia (A2–A1) en la cantidad correspondiente de metilresorufina (el valor B). La actividad de la lipasa se calculó como sigue: Actividad de la lipasa (mU/mg) = ΔB/ (ΔT × mg), donde mg es el peso de la muestra de tejido en cada mezcla de reacción. Los datos resultantes se sometieron luego al análisis estadístico como se describe a continuación.

Se usó un kit colorimétrico/fluorométrico de cuantificación de ácidos grasos libres (BioVision Inc.) para detectar los ácidos grasos de cadena larga no unidos en cada muestra de camarón. Para las muestras de hemocitos y hemolinfa, se recogió hemolinfa de camarón y los hemocitos se separaron por centrifugación. Las muestras de hemocitos, hemolinfa, estómago y hepatopáncreas se homogeneizaron con 200 μl de cloroformo-Triton X-100 (1% Triton X-100 en cloroformo puro), y después de la centrifugación (10 min a 13.000 × g), la fase orgánica (fase inferior) de cada muestra, se secó al aire a 50 °C hasta que no quedó solución y luego se secó al vacío durante 30 min. A continuación, el sedimento (los lípidos secos) de cada muestra se disolvió en 200 μl de tampón de ensayo de ácidos grasos y 50 μl de la solución resultante se transfirieron a un pozo en una placa de 96 pozos. Se añadió reactivo ACS (2 μl) y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Finalmente, se agregaron al pocillo 50 μl de la mezcla de reacción (44 μl de tampón de ensayo de ácidos grasos, 2 μl de sonda de ácidos grasos, 2 μl de mezcla de enzimas y 2 μl de potenciador) y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 30 minutos más a 37ºC. ºC Para la calibración, se usaron muestras de ácido palmítico y blancos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia de cada muestra se midió a Ex/Em = 535/590 nm y se generó una curva estándar de ácido palmítico a partir de una serie de concentraciones que oscilaban entre 0 y 10 nmol. Esto se usó para convertir las lecturas de muestra a la cantidad correspondiente de FFA (Fa) en cada pocillo. A continuación, se calculó la concentración de FFA como sigue: Concentración de ácidos grasos (nmol/mg) = Fa/Smg donde Smg es el peso del tejido de la muestra en cada mezcla de reacción. Los datos resultantes se sometieron al análisis estadístico como se describe a continuación.

Soluciones madre del inhibidor de CPT1 Etomoxir (2[6(4-clorofenoxi)hexil]oxirano-2-carboxilato; Tocris Bioscience) e inhibidor de FAS C75 (ácido 4-metilen-2-octil-5-oxotetrahidrofurano-3-carboxílico; ENZO Life Sciences) se prepararon disolviendo en ddH2O y DMSO respectivamente. Antes de su uso, ambos stocks se diluyeron con PBS a la concentración requerida.

Se utilizó un kit de ensayo de proporción ApoSENSOR ADP/ATP (BioVision) para determinar la proporción ATP/ADP en hemocitos agrupados (4–5 agrupaciones; 4 camarones por agrupamiento) recolectados a las 12 y 24 hpi. El procedimiento fue ligeramente modificado de Li et al.40 y Chen et al.41. Después de recolectar la hemolinfa de los camarones desafiados, se reunió y centrifugó a 3000 × g durante 10 min a 4 ° C, y el sedimento resultante de hemocitos se suspendió en 50 μl de tampón de liberación de nucleótidos. A continuación, esta suspensión se añadió a pocillos que contenían 10 µl de enzima de control de ATP y 90 µl de tampón de liberación de nucleótidos en una placa ELISA de 96 pocillos. El control de luminiscencia de fondo se preparó solo con enzima de control de ATP y tampón de liberación de nucleótidos. Para medir el nivel de ATP en los hemocitos, se realizó la primera medición para el control (Datos A) y la muestra (Datos B) después de 2 min de incubación. Para medir el nivel de ADP en los hemocitos, se volvió a realizar una segunda medición para la muestra (Datos C). A continuación, se añadió enzima convertidora de ADP (1 µl) a la muestra y se tomó una medida final (Datos D). Todas las mediciones se realizaron con un luminómetro. La relación ATP/ADP se calculó como: (Datos B) - (Datos A)/[(Datos D - Datos A) - (Datos C - Datos A)].

Para investigar la liberación de viriones, los hemocitos se separaron de la hemolinfa por centrifugación. El ADN genómico total se extrajo tanto de los hemocitos como de la hemolinfa utilizando un kit de extracción de ADN DTAB/CTAB (GeneReach Biotechnology Corp.). El número de copias del genoma de WSSV se cuantificó mediante un sistema cuantitativo IQ RealTM WSSV (GeneReach Biotechnology Corp.), una PCR comercial en tiempo real, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para examinar el papel de la β-oxidación y los LCFA en la replicación de WSSV, utilizamos el inhibidor de CPT1 Etomoxir y el inhibidor de FAS C75, respectivamente. Para la inhibición de CPT1, a los camarones se les inyectó por vía intramuscular Etomoxir (62,5 mg/g de camarón) o vehículo PBS (control) 10 h después de la exposición a WSSV. Se recolectaron muestras agrupadas de hepatopáncreas (4–5 muestras agrupadas; 3 camarones por grupo) a las 12 y 24 hpi. Se utilizó un perfil de ácidos grasos basado en GC/MS para monitorear la dinámica de cada ácido graso de cadena larga detectado. Para la inhibición de FAS, las dosis y el momento del tratamiento con C75 se modificaron con respecto a nuestro estudio anterior23. Los camarones se trataron con el inhibidor de FAS C75 (30 μg/g de camarón) 4 h después de inyectarlos con WSSV o PBS. Se recolectaron muestras de hepatopáncreas y estómago (4–5 muestras agrupadas; 3 camarones por grupo) a las 12 y 24 hpi y se usaron para el análisis GC/MS.

La lipodomia de camarones basada en cromatografía de gases (GC/MS) basada en espectrometría de masas se realizó con base en los métodos descritos por Hsieh et al.23. En resumen, primero se añadió a los tejidos de los camarones una solución de cloroformo que contenía un control interno de ácidos grasos C22:0 (10-30 mg por muestra), y luego se extrajeron los ácidos grasos de los tejidos mediante homogeneización con 2:1 (v/v). ) cloroformo/metanol. Después de agitar durante la noche y eliminar los residuos mediante filtración, la fracción líquida se secó a 40 °C usando un evaporador rotatorio. Los sedimentos resultantes de cada muestra se volvieron a disolver con cloroformo puro, se transfirieron a un vial de reacción de 10 ml y luego se secaron de nuevo usando el evaporador rotatorio. Las muestras secas se sometieron a saponificación/esterificación seguida de análisis lipodomics GC/MS utilizando una máquina de cromatografía de gases 7890A equipada con un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple 5975C (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.) y una columna capilar Supelco SP-2380 ( 30 mx 0,25 mm id; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) como se describió anteriormente23. Se utilizó MSD Chemstation G1701EA E.02.02.1431 (Agilent Technologies, Inc., EE. UU.) para el control del instrumento, la adquisición de datos y el análisis de datos. Se utilizó la biblioteca espectral de masas NIST 11 (Gaithersburg, MD, EE. UU.) para ayudar a identificar los ésteres metílicos de FA (FAME), junto con los tiempos de retención de los estándares adquiridos de Sigma-Aldrich. Los ácidos grasos identificados se cuantificaron frente al patrón interno de ácidos grasos C22:0 y se calculó la cantidad de FA por mg de tejido. Los datos resultantes se sometieron al análisis estadístico como se describe a continuación.

Los cálculos de datos y gráficos se realizaron en Microsoft Excel y Graphpad Prism 9 respectivamente. Los datos sin procesar se recolectaron de al menos tres réplicas independientes en cada experimento, como se describe en detalle en la sección correspondiente del método. Después de aplicar la regla empírica como se describió anteriormente51 en todos los datos para la detección y exclusión de valores atípicos estadísticos, las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se analizaron mediante la prueba t de Student para comparar tratamientos múltiples. Los datos proporcionados en Datos complementarios 1 se utilizan para generar las cifras presentadas en este estudio. Los datos se presentan como media ± SD. La significación se indica mediante *p < 0,05, **p < 0,01.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para las cifras principales presentadas en este estudio se proporcionan como Datos complementarios 1. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación fue financiada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 106-2321-B-006-010, MOST 108-2314-B-006-096-MY3, MOST 110-2634-F-006-019 y NSTC 111 -2628-B-006-017). También agradecemos calurosamente al Sr. Paul Barlow, Universidad Nacional Cheng Kung, por su útil crítica de este manuscrito.

Departamento de Biotecnología y Ciencias de la Bioindustria, Facultad de Biociencia y Biotecnología, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan, Taiwán

Yen Siong Ng, Cheng-Shun Cheng, Yi-Ting Tseng, Shu-Ting He, Chun-Yuan Li, Shu-Wen Cheng, Yi-Min Chen, Ramya Kumar y Han-Ching Wang

Organización de Investigación para Nano y Life Innovations, Universidad de Waseda, Tokio, Japón

Masahiro Ando y Haruko Takeyama

Centro Internacional para el Desarrollo Científico de la Acuicultura del Camarón, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan, Taiwán

Ramya Kumar y Han Ching Wang

Departamento de Acuicultura, Universidad Nacional de Ciencia y Tecnología de Pingtung, Pingtung, Taiwán

Chun Hung Liu

Departamento de Ciencias de la Vida y Biociencias Médicas, Universidad de Waseda, Tokio, Japón

Haruko Takeyama

Laboratorio de Innovación Abierta de Grandes Datos Biológicos Computacionales (CBBD-OIL), Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tokio, Japón

Haruko Takeyama

Instituto de Investigación Avanzada de Dinámica de Biosistemas, Instituto de Investigación de Ciencias e Ingeniería de Waseda, Tokio, Japón

Haruko Takeyama

Departamento de Biociencias Marinas, Universidad de Ciencias y Tecnologías Marinas de Tokio, Tokio, Japón

Ikuo Hirono

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C.-SC, H.-CW, MA, Y.-MC e Y.-TT diseñaron el estudio. C.-SC, S.-TH, C.-YL e Y.-TT realizaron experimentos. C.-SC, S.-TH, C.-YL, YSN y. Y.-TT analizó los datos. C.-HL, H.-CW, HT, IH e Y.-MC aportaron recursos. C.-SC, RK, S.-WC e YSN escribieron el artículo. C.-HL, HT, IH, H.-CW, MA e Y.-MC supervisaron el proyecto.

Correspondencia a Han-Ching Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Liu Haipeng, Claudio Mejía-Ruiz e Ilie Racotta por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Gabriela da Silva Xavier, David Favero. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ng, YS, Cheng, CS., Ando, ​​M. et al. El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) modula el metabolismo de los lípidos en el camarón blanco. Commun Biol 6, 546 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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Recibido: 26 Septiembre 2022

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 20 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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