Vesículas extracelulares de Gram

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May 22, 2023

Vesículas extracelulares de Gram

npj Biopelículas y Microbiomas

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 30 (2023) Citar este artículo

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Ahora se sabe que la microbiota intestinal afecta el sistema inmunológico del huésped. Una forma de comunicación bacteriana con las células huésped es a través de la secreción de vesículas, pequeñas estructuras de membrana que contienen diversos cargamentos. La investigación sobre vesículas secretadas por bacterias intestinales Gram-positivas, sus mecanismos de interacción con el huésped y sus efectos inmunomoduladores son todavía relativamente escasas. Aquí caracterizamos el tamaño, el contenido de proteínas y los efectos inmunomoduladores de las vesículas extracelulares (EV) secretadas por una cepa simbionte del intestino humano Gram-positiva recién secuenciada: Bifidobacterium longum AO44. Encontramos que los EV de B. longum ejercen efectos antiinflamatorios, induciendo la secreción de IL-10 tanto de esplenocitos como de cocultivos de células dendríticas (DC)-CD4+ T. Además, el contenido de proteínas de los EV mostró un enriquecimiento en los transportadores ABC, las proteínas de detección de quórum y las proteínas de unión a solutos extracelulares, que previamente demostraron tener una función destacada en el efecto antiinflamatorio de otras cepas de B. longum. Este estudio subraya la importancia de las vesículas bacterianas para facilitar los efectos inmunomoduladores de las bacterias intestinales en el huésped y arroja luz sobre las vesículas bacterianas como futuras terapias.

En las últimas dos décadas, muchos estudios demostraron los profundos efectos de la microbiota intestinal en la fisiología humana1,2,3, con una gama de funciones beneficiosas predominantemente relacionadas con la maduración y modulación del sistema inmunitario3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14. Las bacterias inmunomoduladoras fueron identificadas durante mucho tiempo por nosotros y otros15,16,17,18, sin embargo, solo se han caracterizado unas pocas moléculas inmunomoduladoras derivadas de bacterias19,20,21. Las vesículas bacterianas han ganado interés como una entidad que puede interactuar tanto con las células bacterianas como con las del huésped22. Las vesículas son estructuras de membrana secretadas por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. El tamaño de las vesículas varía de 20 a 300 nm y transportan diversas cargas, incluidas proteínas (tanto de membrana como citoplásmicas), peptidoglucano, ácido nucleico y toxinas, así como lipopolisacáridos (LPS, en bacterias gramnegativas). Las vesículas interactúan con las bacterias y las células huésped al internalizar y liberar su carga. Estas interacciones hacen que las vesículas sean ideales para la entrega molecular a larga distancia a bacterias vecinas o células inmunitarias del huésped. Como tal, las vesículas bacterianas pueden explotarse para posibles tratamientos23. Aunque las vesículas producidas por bacterias Gram-negativas han sido estudiadas desde la década de 196024, la producción de vesículas extracelulares (EVs) por bacterias Gram-positivas se demostró 30 años después25. Si bien se descubrió en la década de 1990, el interés en la vesiculogénesis y los efectos inmunomoduladores de los vehículos eléctricos Gram-positivos aumentó en la última década26,27, aún con la mayor atención en bacterias patógenas como Staphylococcus aureus28, Mycobacterium tuberculosis29 y Bacilo anthracis30,31. Algunos estudios mostraron que solo las bacterias Gram-positivas metabólicamente activas secretan EV, a diferencia de las bacterias Gram-negativas32,33, sin embargo, estudios recientes sugieren que los EV también se secretan en un proceso de "muerte celular burbujeante"34. Hasta la fecha, existe una comprensión limitada de los factores involucrados en la regulación genética de la vesiculogénesis y el estado de membrana de la bacteria que permite la liberación de EV26,35. Entre los miembros de la microbiota intestinal grampositiva, el género Bifidobacterium ganó interés, ya que se sabe que degrada los oligosacáridos de la leche humana y es muy frecuente en el tracto gastrointestinal de los lactantes36, así como en los intestinos de los adultos37. Además, se encontró que las especies del género Bifidobacterium afectan tanto al sistema inmunitario innato como al adaptativo, principalmente con efectos antiinflamatorios16,38, con algunas moléculas efectoras caracterizadas hasta la fecha39,40. Si bien se demostró que varias moléculas extracelulares, como Bifidobacterium bifidum pili40 y exopolisacáridos de Bifidobacterium breve39, inducen efectos antiinflamatorios, los mecanismos a través de los cuales estas moléculas interactúan con el huésped no se comprenden completamente. Un miembro importante del género Bifidobacterium es Bifidobacterium longum. Esta especie es muy abundante en el intestino humano, incluso entre las especies de Bifidobacterium41. Se descubrió que B. longum tiene un efecto antiinflamatorio in vitro en líneas celulares42, in vivo en modelos murinos43 y, lo que es más importante, en ensayos clínicos de enfermedades inflamatorias del intestino (EII)44. Estos efectos antiinflamatorios se atribuyeron principalmente a su capacidad para reducir el estrés oxidativo, regular a la baja la secreción de citoquinas inflamatorias y aumentar el contenido de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en el intestino45. Sin embargo, aún no se han descubierto los mecanismos moleculares que subyacen a sus interacciones con el huésped y los efectos terapéuticos. Varios estudios han destacado los EV secretados por especies de Bifidobacterium como antiinflamatorios con un uso potencial como adyuvantes en el tratamiento de alergias46,47. Por ejemplo, se descubrió que las vesículas de B. bifidum interactúan con las células dendríticas (DC), seguido de la diferenciación de las células T reguladoras (T-regs)47. Curiosamente, un estudio reciente destacó el potencial de las vesículas de B. longum para aliviar la alergia alimentaria a través de la inducción de la apoptosis en los mastocitos46. Aunque los estudios sobre los efectos inmunomoduladores de las vesículas de simbiontes intestinales tanto gramnegativos como grampositivos están comenzando a surgir26, solo unos pocos descubrieron las moléculas y los mecanismos subyacentes a estos efectos. Además, se demostró que los vehículos eléctricos de varias cepas de la misma especie inducen distintos efectos inmunomoduladores con diferentes mecanismos, lo que destaca el gran potencial de las vesículas derivadas de las miles de cepas bacterianas que se encuentran en el intestino humano48. Aquí demostramos los efectos inmunomoduladores de las vesículas bacterianas intestinales producidas por una cepa AO44 de Bifidobacterium longum recién secuenciada y anotada. Nuestros resultados abren una nueva vía para futuros estudios sobre los posibles efectos terapéuticos de las vesículas bacterianas.

Se extrajo el ADN de la cepa AO44 de B. longum, se secuenció el genoma completo y se depositó en GenBank, número de acceso PRJNA908295. Para determinar qué entidad bacteriana estimula una respuesta inmunitaria antiinflamatoria (es decir, secreción de IL-10), se realizó un fraccionamiento químico mediante extracciones con metanol/cloroformo (MeOH/CHCl3). Tanto las células bacterianas como los medios acondicionados de B. longum AO44 cultivados en medio anaeróbico Gifu (GAM) o suplementado con infusión de cerebro y corazón (BHIS) se recolectaron y se extrajeron las fracciones hidrofóbicas/hidrofílicas (Fig. 1a, b). Se utilizaron esplenocitos de ratón libres de patógenos específicos (SPF) para evaluar los efectos inmunomoduladores de cada fracción química. Los esplenocitos se activaron con anti-CD3 y se complementaron con cada fracción bacteriana. Los esplenocitos de ratón SPF, activados con anti-CD3, permiten estudiar los efectos de las entidades bacterianas sobre toda la población de células inmunitarias que se encuentran en el bazo. La fracción de CHCl3 de las bacterias cultivadas tanto en GAM como en BHIS ejerció la mayor secreción de IL-10 por parte de los esplenocitos en comparación con otras fracciones. Se presenta el cambio de pliegue del control (esplenocitos activados con anti-CD3) (Fig. 1c, d). Los efectos inmunomoduladores de la fracción del medio acondicionado concentrado (10x) (es decir, el medio acondicionado) fueron similares a los de la fracción CHCl3, lo que indica que una entidad bacteriana que existe en ambas fracciones contiene el componente inmunomodulador activo.

a Ilustración del crecimiento bacteriano y separación de células/sobrenadante. b Ilustración del fraccionamiento químico de los medios acondicionados bacterianos y las células. c Cambio de veces (en comparación con el control) de las concentraciones de IL-10 en esplenocitos expuestos a cualquiera de las fracciones químicas generadas a partir de B. longum cultivadas en medio BHIS. d Cambio de veces (en comparación con el control) de las concentraciones de IL-10 en esplenocitos expuestos a cualquiera de las fracciones químicas generadas a partir de B. longum cultivadas en medios GAM. Cada punto representa una repetición técnica de tres experimentos independientes. ANOVA de Brown-Forsythe y Welch, *P < 0,05 y **P < 0,01. Las barras de error representan la fracción sd CHCl3 = fracción orgánica hidrófoba, fracción MeOH = fracción orgánica hidrófila, fracción H2O = fracción polar hidrófila, SupX10 = medio acondicionado concentrado. Las figuras 1a, b se crearon con BioRender.com.

De acuerdo con las características químicas del CHCl3, esta fracción contiene en su mayoría moléculas hidrofóbicas, como las membranas celulares bacterianas. Dado que tanto la fracción de CHCl3 como la fracción sobrenadante concentrada tuvieron un efecto similar en la secreción de IL-10, y los EV están compuestos por membranas celulares bacterianas secretadas a los medios condicionados (es decir, presentes en los sobrenadantes), decidimos centrarnos en caracterizar los EV como la entidad bacteriana activa. Los EV de B. longum AO44 se aislaron a través de una serie de filtraciones y ultracentrifugación (Fig. 2a) para lograr EV en gránulos. Como control, se pasó medio BHIS sin bacterias por el mismo proceso de filtrado y ultracentrifugación para confirmar que el efecto inmunitario se deriva de una entidad bacteriana y no del propio medio concentrado. Los vehículos eléctricos se caracterizaron (Fig. 2b-d) por morfología y tamaño. Una imagen Cryo-TEM representativa confirma la presencia de las vesículas en el sedimento ultracentrifugado y demuestra su morfología (Fig. 2b). Además, se identificaron EV brotando de la membrana celular bacteriana y rodeando las células bacterianas en sus medios de crecimiento, utilizando Cryo-TEM (Fig. 2c). La distribución de tamaño de los vehículos eléctricos se midió con NanoSight, y la mayoría de las vesículas tenían un tamaño de 150 nm (Fig. 2d). Para verificar que los EV fueron sintetizados por B. longum, las bacterias se cultivaron en presencia de D-aminoácidos fluorescentes para marcar las proteínas recién sintetizadas, y específicamente los peptidoglicanos de las bacterias. Las bacterias metabólicamente activas incorporan los D-aminoácidos fluorescentes para sintetizar proteínas. El marcaje metabólico por D-aminoácidos fluorescentes es un método que permite marcar los EV bacterianos recién sintetizados durante su producción, sin necesidad de marcarlos después de la extracción, un paso que podría dejar rastros de los marcadores de fluorescencia que pueden causar artefactos de marcaje no específicos. . Las vesículas marcadas se identificaron y diferenciaron de las vesículas no marcadas mediante una citometría de flujo específica diseñada para detectar partículas pequeñas (Fig. 2e, f).

a Ilustración del proceso de aislamiento de vesículas extracelulares. b Imágenes Cryo-TEM de diferentes vehículos eléctricos liberados por bacterias de la misma muestra. 'S' en 'b' indica la película de soporte perforada TEM. Todas las barras corresponden a 100 nm. c Imágenes Cryo-TEM de las bacterias en varias etapas de formación de EV: (1) La punta de una bacteria. El asterisco indica la posible formación de vehículos eléctricos vistos en proyección a través de la pared celular. (2) Un EV que se forma entre la pared celular y la cápsula (flecha). (3) Un EV completamente formado entre la pared celular y la cápsula (flecha); 'S' denota la película de soporte perforada TEM. (4) La punta de la bacteria después de la liberación de un EV; una flecha apunta a la pared celular distorsionada; las puntas de flecha apuntan a los vehículos eléctricos liberados. Se añade una ampliación de (4) a la derecha. Las barras de escala corresponden a 100 nm. d Distribución de tamaño y concentración (1e10) de vesículas extracelulares de B. longum medidas en NanoSight. Las barras de error representan vesículas extracelulares sd e, f B. longum marcadas con fluorescencia mediante marcado con D-aminoácidos, detectadas en citometría de flujo. e vesículas no marcadas y f vesículas marcadas. La figura 2a se creó con BioRender.com.

Se analizó el contenido de proteoma de B. longum AO44 EV mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Se identificaron y cuantificaron 463 proteínas en las tres repeticiones. Las vías KEGG enriquecidas se presentan en porcentajes en la Fig. 3a y la Tabla complementaria 1c. Los tres grupos más grandes de proteínas pertenecieron a: vías metabólicas (16,9%), ribosomas (9,4%) y biosíntesis de metabolitos secundarios (7,7%), el cuarto grupo más grande fue el de transportadores ABC (6,1%) y el sexto grupo más grande fue detección de quórum (4,9%). Además, los transportadores ABC fueron la categoría más significativamente enriquecida según la base de datos INTERPRO con recuentos de proteínas de 31 y un valor p de 1e-10 (Fig. 3b y Tabla complementaria 1b). INTERPRO confirmó que otras categorías de proteínas relacionadas con los transportadores ABC están enriquecidas en los EV AO44 de B. longum, incluidas las proteínas permeasas transmembrana, las proteínas de unión a nucleótidos y las proteínas periplásmicas de unión a solutos altamente específicas (Fig. 3b). El análisis STRING y el mapa de interacciones de este subconjunto de transportadores ABC y el subconjunto de detección de quórum analizado por KEGG se presentan en la Fig. 3c, d. Para tener en cuenta, el subconjunto de transportadores ABC también contenía proteínas que pertenecen a la vía de detección de quórum y una vía de unión a ATP (Fig. 3c). El subconjunto de detección de quórum incluía proteínas involucradas en la biosíntesis de ácidos grasos, exportación de proteínas, transportadores ABC y proteínas que son componentes intrínsecos de la membrana (Fig. 3d). Todas las proteínas identificadas en las vesículas se enumeran en la Tabla complementaria 1 (la Tabla complementaria 1a incluye la lista completa de componentes integrales de la membrana, la 1b complementaria incluye el análisis INTERPRO y la 1c complementaria el análisis KEGG).

a Vías KEGG enriquecidas en B. longum EV. b Categorías de familias de proteínas y dominios enriquecidos de la base de datos INTERPRO (valor P y recuento de proteínas) según lo analizado por DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD en el Laboratorio Nacional de Frederick). El enriquecimiento se realizó contra el fondo del genoma bacteriano. c Análisis STRING y mapa de interacciones del grupo de transportadores ABC según lo anotado por la base de datos de la vía KEGG (púrpura: transportadores ABC, azul: detección de quórum, gris: unión ATP). d Análisis STRING y mapa de interacciones de las proteínas de detección de quórum según lo anotado por la base de datos de la vía KEGG (azul: detección de quórum, amarillo: biosíntesis de ácidos grasos, marrón: exportación de proteínas, púrpura: transportadores ABC, azul claro: componente intrínseco de la membrana).

Para validar que el perfil proteico de los EV difiere del perfil proteico de las células bacterianas y los sobrenadantes, también se realizó un análisis de proteómica en las células bacterianas y los sobrenadantes (Tabla complementaria 2). Los perfiles de intensidades de proteínas de las células bacterianas se compararon con los datos de EV y con las proteínas analizadas de los sobrenadantes después de la ultracentrifugación. Las réplicas de cada grupo se agruparon mediante un agrupamiento no supervisado, representado en un mapa de calor (Fig. 4a). Se identificaron múltiples proteínas intensas en la proteómica de las células bacterianas pero no en los EV, y en los EV pero no en los sobrenadantes, lo que indica que los EV contienen un contenido de proteína específico, que es exclusivo de los EV y diferente del contenido de proteína total. de las células, así como del contenido de proteína secretada. Las proteínas y los dominios transportadores ABC se enriquecieron significativamente en los EV en comparación con las células bacterianas según la base de datos INTERPRO (Fig. 4b). Las proteínas diferenciales identificadas en las células bacterianas (derecha) y los vehículos eléctricos (izquierda) se representan en el gráfico del volcán (Fig. 4c).

una representación de mapa de calor de las intensidades de proteínas de células bacterianas, EV y muestras de sobrenadantes, según lo analizado por el software Perseus. Este agrupamiento jerárquico no supervisado se realizó utilizando un análisis de distancia euclidiana. b Categorías de familias de proteínas y dominios enriquecidos de la base de datos INTERPRO (valores P) según lo analizado por DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD en Frederick National Laboratory) comparando células bacterianas y vehículos eléctricos. El enriquecimiento se realizó contra el fondo del genoma bacteriano. c Representación gráfica de volcán de las proteínas diferenciales identificadas en las células bacterianas (derecha) y los vehículos eléctricos (izquierda). Rojo: transportadores ABC, azul: proteínas de unión a ATP, verde: membrana plasmática, naranja: proteínas ribosómicas.

Se introdujeron EV en esplenocitos de ratón SPF en concentraciones descendentes y se midieron las concentraciones de IL-10 e IL-17 en los medios de las células. La concentración de IL-10 fue más alta en la dilución más baja de EV (1:50) en comparación con todas las demás diluciones y controles. Las concentraciones de IL-10 disminuyeron de forma no lineal cuando las vesículas se diluyeron a una concentración no efectiva a una dilución de 1:1250 (Fig. 5a). Por el contrario, las concentraciones de IL-17 no se vieron afectadas por las vesículas en todas las concentraciones (Fig. 5b). Las frecuencias de células CD8+ Ki67+ PD1+ y CD4+ Ki67+ PD1+ se midieron mediante citometría de flujo para evaluar la proliferación y activación celular. Las frecuencias de las células CD8+ Ki67+ PD1+ y CD4+ Ki67+ PD1+ fueron más altas cuando las células se expusieron a la dilución más baja de vesículas (1:50), siendo CD8+ Ki67+ PD1+ ligeramente más significativo en comparación con otras diluciones y los controles (Fig. 5c, d ). Para investigar más a fondo la respuesta antiinflamatoria de las células presentadoras de antígenos y las células T a los vehículos eléctricos de B. longum, se cocultivaron células T DC-CD4+ en presencia de los vehículos eléctricos bacterianos. Los niveles de IL-10 fueron significativamente más altos en las células activadas con EV de B. longum en comparación con las células activadas con BHIS concentrado (x1000, Fig. 5e). El cambio de veces de IL-17 no mostró diferencias significativas, e incluso una ligera disminución, en las células activadas con EV en comparación con las células activadas con BHIS concentrado (x1000, Fig. 5f). Tanto la inducción de IL-10 como de IL-17 en el cocultivo de células T DC-CD4+ se alineó con la inducción en el ensayo de esplenocitos completos.

a Concentraciones de IL-10 yb Concentraciones de IL-17 en medios de esplenocitos después de la exposición a anti-CD3; o anti-CD3 combinado con BHIS concentrado (gris claro, dilución 1:50) o diluciones descendentes de vesículas extracelulares. c Frecuencia de células CD4+ Ki67+ PD1+ del total de células CD4 después de la exposición a anti-CD3; anti-CD3 combinado con BHIS concentrado (dilución 1:50) o diluciones descendentes de vesículas extracelulares. d Frecuencia de células CD8+ Ki67+ PD1+ del total de células CD8 después de la exposición a anti-CD3 o anti-CD3 combinado con BHIS concentrado (dilución 1:50) o diluciones descendentes de vesículas extracelulares. e, f Cambio de veces (en comparación con el control) de las concentraciones de IL-10 (e) o IL-17 (f) en medios de células T DC-CD4+ expuestos a EV de B. longum o BHIS concentrado. Cada punto representa una repetición biológica de tres experimentos independientes. a–d ANOVA ordinario de una vía, e, f prueba t no pareada. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. Las barras de error representan sd

La microbiota intestinal tiene importantes efectos potenciales sobre nuestra salud, tanto que puede considerarse una mina de oro para las moléculas terapéuticas derivadas de la bacteria19,20,21. Una ruta principal de los efectos terapéuticos inducidos por bacterias en el huésped es a través de la comunicación bacteriana con el sistema inmunitario del huésped6,7,8,9,16,49. Por ejemplo, los SCFA producidos por bacterias intestinales pueden inducir efectos antiinflamatorios en el huésped a través de la inducción de T-regs50. Sin embargo, los modos de tales comunicaciones comensal-huésped y las moléculas inmunomoduladoras bacterianas involucradas aún se desconocen en gran medida. Un modo posible de interacciones microbio intestinal-huésped es a través de la secreción de vesículas bacterianas, que pueden llegar a las células huésped, potencialmente incluso en sitios distantes. De hecho, un polisacárido de la superficie externa (PS) de la bacteria Gram-negativa Bacteroides fragilis se comunica con las células huésped a través de vesículas de la membrana externa bacteriana (OMV), lo que alivia la colitis experimental en ratones51. Están surgiendo estudios sobre vesículas extracelulares (EV) de bacterias intestinales Gram-positivas, sin embargo, todavía son relativamente escasos, en comparación con los estudios sobre OMV Gram-negativas46,47. Específicamente, algunos estudios recientes demostraron los efectos fisiológicos de los vehículos eléctricos producidos por bacterias del género Bifidobacterium. De este género, Bifidobacterium longum es un comensal intestinal grampositivo común con efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores.

Aquí elegimos estudiar una cepa AO44 de B. longum derivada del intestino humano recién aislada, con el objetivo de caracterizar sus entidades inmunomoduladoras. Primero realizamos el fraccionamiento químico de células bacterianas y sobrenadantes de B. longum AO44 para descubrir las características químicas de los compuestos bacterianos inmunomoduladores activos. Se eligieron dos medios ricos en crecimiento (BHIS y GAM), que se utilizan predominantemente para cultivar especies de Bifidobacterium. Realizamos fraccionamientos de CHCl3:MeOH:H2O, que separa las moléculas en fracciones hidrofóbicas e hidrofílicas crudas, fracciones orgánicas y polares. Dado que se demostró que las bacterias del género Bifidobacterium inducen principalmente efectos antiinflamatorios38, analizamos la inducción de la citoquina antiinflamatoria IL-10 por las fracciones activas. Tanto la fracción sobrenadante concentrada como la fracción de células CHCl3 tuvieron el mayor efecto sobre la secreción de IL-10 por parte de las células inmunitarias, tanto en medios GAM como BHIS. La fracción orgánica no polar CHCl3 contiene moléculas hidrofóbicas como partes de membrana y lípidos. Por lo tanto, especulamos que el componente activo es una sustancia celular que se encuentra dentro de ambos. Dado que el sobrenadante se separó de las células bacterianas mediante centrifugación, es probable que las partes de la membrana hidrofóbica encontradas sean restos celulares o vehículos eléctricos secretados por las células bacterianas al medio. Por lo tanto, a continuación aislamos EV de bacterias cultivadas en BHIS y confirmamos su capacidad para inducir la secreción de IL-10 pero no de IL-17 en cultivo de esplenocitos completos, lo que enfatiza su efecto antiinflamatorio.

Exploramos más a fondo sus posibles efectos inmunológicos adicionales e identificamos que estos mismos EV también son capaces de aumentar las frecuencias de células CD4+ Ki67+ PD1+ y CD8+ Ki67+ PD1+ en comparación con el control. La regulación al alza de CD4+ Ki67+ PD1+ y CD8+ Ki67+ PD1+ indica activación (PD1+) y proliferación (Ki67+) de células CD4 y CD8, lo que se alinea con la inducción de IL-10. Para obtener una visión más mecánica de los efectos antiinflamatorios de los vehículos eléctricos en las células inmunitarias del huésped, exploramos sus efectos inmunomoduladores en el cocultivo de células T DC-CD4+. Aquí, como con los esplenocitos completos, los EV indujeron la secreción de IL-10 y no de IL-17. Esto nuevamente apunta a sus efectos antiinflamatorios e identifica a las DC y las células T CD4+ como actores principales en esta interacción. Una vez que identificamos los efectos inmunomoduladores de los vehículos eléctricos, caracterizamos su contenido mediante proteómica. El análisis proteómico reveló un contenido de proteínas único en los EV que difiere del contenido de proteínas de las células bacterianas enteras y las proteínas secretadas en el sobrenadante. Específicamente, se observó un enriquecimiento de transportadores ABC y proteínas de detección de quórum en los vehículos eléctricos. Los sistemas de transporte bacterianos de alta afinidad están involucrados en el transporte activo de solutos a través de la membrana citoplasmática, incluidas las proteínas transmembrana permeasa, las proteínas de unión a nucleótidos y las proteínas periplásmicas de unión a soluto altamente específicas, todas ellas presentes en las vesículas. Para tener en cuenta, los transportadores ABC y las proteínas de unión a soluto extracelulares (incluida la "familia 5") se enriquecieron en los vehículos eléctricos de otra cepa de B. longum que demostró aliviar las alergias46. Además, se demostró previamente que las proteínas de detección de quórum estaban enriquecidas en OMV Gram-negativas, lo que promueve la formación de biopelículas bacterianas52,53. Por último, demostramos el etiquetado de fluorescencia específico de las vesículas bacterianas, lo que puede permitir futuros estudios sobre las interacciones EV-host. Para resumir, caracterizamos los EV de morfología, tamaño, contenido y actividades inmunomoduladoras de un B. longum derivado del intestino recién aislado. Nuestros resultados que demuestran la activación de las células inmunitarias mediada por EV pueden conducir a futuros estudios que evalúen sus efectos in vivo, en la salud y la enfermedad, y que consideren estos EV específicos como posibles terapias futuras.

B. longum AO44 se descongeló en placas de agar Brain Heart Infusion (BHI, BD BBLTM) complementado con 5 µg/ml de hemina (Alfa Aesar) en NaOH 1 N y 2,5 µg/ml de vitamina K (Thermo Fisher Scientific) en EtOH al 100 % ( anteriormente denominado BHIS), a 37 °C en cámara anaeróbica, 85 % N2, 10 % CO2, 5 % H2 (COY).

B. longum AO44 se precultivó a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Primero, en 10 ml de BHIS o GAM en tubo Hungate de ~20 ml, y luego se inoculó al 0,5 % v/v a 900 ml de BHIS o GAM en botella de vidrio de 1 L a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Después de 4 días de incubación a 37 °C, el sobrenadante y las células se separaron por centrifugación (7500 × g, centrífuga Thermo Fisher Scientific Sorvall R6 con rotor de botella 1Lx4).

Fraccionamiento del sobrenadante: se preparó una fracción de sobrenadante 10x (es decir, sobrenadante crudo concentrado) evaporando el sobrenadante centrifugado a 1/10 del volumen mediante un evaporador rotatorio. Las fracciones de sobrenadante-metanol se prepararon como sigue: primero se liofilizaron hasta sequedad 10 ml del sobrenadante centrifugado. Se añadieron 30 ml de metanol al residuo seco. Después de mezclar con espátula y sonicación (15 min), la solución mezclada se dejó durante la noche a temperatura ambiente (TA) para permitir que las moléculas se extrajeran completamente en metanol. La solución de metanol se eliminó cuidadosamente de los residuos insolubles. Esta fracción de metanol (30 ml) se concentró al vacío hasta sequedad y se volvió a disolver en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). La fracción de sobrenadante-agua se preparó como sigue: los residuos insolubles del proceso anterior se disolvieron en 1 ml de agua.

Fraccionamiento del sedimento celular: la fracción de cloroformo celular se preparó de la siguiente manera: los sedimentos celulares del cultivo de 1 L se empaparon en 300 ml de cloroformo:metanol = 1:1 (v/v). Después de mezclar con espátula y sonicación (15 min), la solución mezclada se dejó durante la noche a temperatura ambiente para permitir que las moléculas se extrajeran completamente en solvente orgánico. El extracto se eliminó de los sedimentos celulares, se filtró y se evaporó al vacío hasta sequedad. Después, al residuo seco se le añadieron 30 ml de cloroformo, se mezcló con una espátula y mediante sonicación (15 min) y se dejó durante la noche a temperatura ambiente para dejar que las moléculas se extrajeran por completo en el disolvente orgánico. La solución de cloroformo se eliminó de los residuos insolubles, se concentró al vacío y posteriormente se volvió a disolver en 3 ml de DMSO. Las fracciones de metanol celular se prepararon de la siguiente manera: los residuos insolubles del proceso de extracción de cloroformo celular anterior se disolvieron en 30 ml de metanol, se mezclaron con espátula y sonicación (15 min) y se dejaron durante la noche a temperatura ambiente para la extracción molecular completa en el disolvente orgánico. La solución de metanol se eliminó de los residuos insolubles, se concentró al vacío y se volvió a disolver en 3 ml de DMSO.

B. longum AO44 se cultivó en 10 ml de BHIS a 37 °C en condiciones anaeróbicas durante la noche. Luego, el cultivo bacteriano se diluyó 1:40 a 200 ml de BHIS y se cultivó durante 8 horas a 37 °C en condiciones anaeróbicas, se realizó una segunda dilución de 1:20 y las bacterias se cultivaron durante 16 horas a 37 °C en condiciones anaeróbicas. El cultivo se centrifugó a 8000 × g durante 30 min, luego se filtró dos veces a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 µm y un filtro de tamaño de poro de 0,22 µm. A continuación, el sobrenadante filtrado se concentró utilizando unidades de filtración centrífuga Centricon® Plus-70 (Merck) con una exclusión de 100 kDa. El sobrenadante restante se ultracentrifugó a 100 000 × g durante 1 hora a 4 °C para obtener el sedimento de vesículas de membrana. Después de la ultracentrifugación, se descartó el líquido superior y el sedimento de vesículas se resuspendió en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco estéril, se filtró con un filtro de tamaño de poro de 0,22 µm y se congeló a -80 °C. La distribución del tamaño de las vesículas se midió usando NanoSight.

Los bazos se recolectaron de ratones C57BL/6 SPF y se rompieron mecánicamente en un filtro de células de 40 µm con 1 ml de tampón de lisis ACK (Thermo Fisher Scientific) durante 1–2 min. Luego, las células se transfirieron a 20 ml de medio RPMI (Sartorius) enfriado con hielo y se centrifugaron durante 10 min a 4 ° C y 300 × g. Las células se lavaron dos veces con 10 ml de RPMI enfriado con hielo, se contaron y se diluyeron con RPMI a 37 °C hasta una concentración final de 2 millones de células/ml. A continuación, las células se complementaron con β-mercaptoetanol 0,05 mM (Merck) y anti-CD3 (0,5 µg/ml, 145-2C11, BioLegend) para una activación subóptima de las células T. Se sembraron 100 µl de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se añadieron 100 µl de fracciones diluidas (dilución 1:250) o vesículas (dilución 1:50–1:31,250). Las células y sus medios se recogieron 5 días después para análisis de citometría de flujo y ELISA.

Se recogieron bazos de ratones C57BL/6 SPF. Para la extracción de DC, los bazos se inyectaron con colagenasa ii en una concentración de 1 mg/ml en medio RPMI, se incubaron a 37 °C durante 30 min y luego se rompieron mecánicamente en un filtro celular de 40 µm. Para la extracción de células T CD4+, los bazos se rompieron mecánicamente en un filtro de células de 40 µm con 1 ml de PBS que contenía suero fetal bovino (FBS) al 2%. A continuación, las células se lavaron dos veces con 10 ml de PBS o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contenía FBS al 2 % y EDTA 1 mM, y se centrifugaron durante 5 min a temperatura ambiente y 300 × g. Las células de cada bazo se usaron para aislar DC usando el kit de enriquecimiento EasySep™ Mouse Pan-DC (STEMCELL Technologies Inc.) o células T CD4+ usando el kit de aislamiento de células T CD4+ EasySep Mouse (STEMCELL Technologies Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron 50 µl de DC aisladas en una placa de 96 pocillos en medio RPMI a una concentración final de 400.000 células/ml. Se sembraron 50 µl de células T CD4+ aisladas en la misma placa de 96 pocillos en medio RPMI a una concentración final de 2 millones de células/ml. A continuación, las células se complementaron con β-mercaptoetanol 0,05 mM (Merck) y anti-CD3 (0,5 µg/ml, 145-2C11, BioLegend) para una activación subóptima de las células T CD4+. A continuación, se añadió el cocultivo de células T DC-CD4+ con 100 µl de vesículas diluidas (dilución 1:50) y BHIS concentrado como control (dilución 1:50). Los medios celulares se recogieron 3 días después para el análisis ELISA.

Las muestras de Cryo-TEM se prepararon en un sistema de vitrificación en ambiente controlado (CEVS)54, a temperatura controlada (25 °C) y 100 % de humedad relativa. Se aplicó una gota de solución de 4 μL a una película perforada recubierta de carbono apoyada en una rejilla TEM (Lacey Formvar/carbon films on 200 mesh copper grid, Ted Pella Inc., Redding, EE. UU.), sostenida por pinzas, dentro del CEVS. Las rejillas se grabaron previamente con plasma en un descargador fosforescente PELCO EasiGlow (Ted Pella Inc., Redding, EE. UU.) para aumentar su hidrofilia. El exceso de líquido se eliminó dos veces de la parte posterior de la cuadrícula usando papel de filtro, formando una película delgada adecuada para la obtención de imágenes. Luego, la solución se vitrificó sumergiendo rápidamente la rejilla en etano líquido en su punto de congelación (-183 ° C). Los especímenes se almacenaron en un dewar de nitrógeno líquido hasta la toma de imágenes. Se tomaron imágenes de las muestras con un Thermo-Fisher Scientific Talos 200C, un TEM de alta resolución operado a 200 kV y equipado con un cañón de emisión de campo (FEG) y una cámara de imágenes directas Falcon III. La transferencia de las muestras al microscopio se realizó utilizando un soporte criogénico Gatan 626 mantenido a -180 °C. Todas las imágenes se registraron con imágenes de baja dosis, para minimizar el daño por radiación de haz de electrones, y con una placa de fase Volta (VPP), para mejorar el contraste de la imagen.

Las bacterias se cultivaron durante la noche a 37 °C en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica en medio BHIS suplementado con HADA (0,8 mM, Tocris, Bio-Techne), volumen total de 10 ml55. Las bacterias marcadas se separaron de los medios mediante centrifugación durante 5 min a 7500 × g. A continuación, las vesículas se aislaron como se describe anteriormente y se detectaron mediante BD FACSymphonyTM A1, un analizador de citometría de flujo con un detector de partículas pequeñas que puede detectar partículas tan pequeñas como 90 nm. Voltajes utilizados: FS - 550, SS - 650, SP SSC - 450, BV421 - 460.

Se utilizó un panel constante de anticuerpos para mantener la coherencia. El panel incluía anticuerpos contra CD4 (RMA-5), CD8 (53-6.7), TCRß (H57-597), CD19 (6D5), Ki67 (16A8), PD-1 (29F.1A12, todos de BioLegend). Para la tinción intracelular de los factores de transcripción, las células se tiñeron en busca de marcadores de superficie y se fijaron en tampón Fix/Perm (eBioscience) durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, y se permeabilizaron en tampón de permeabilización (eBioscience) a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia de anticuerpos. Las células se adquirieron con un BD BioSciences® LSRFortessa y el análisis se realizó con Kaluza® Analysis Software. La concentración, el clon y la fuente de anticuerpos se mantuvieron constantes para asegurar la consistencia en la tinción.

Las concentraciones de IL-10 e IL-17 en esplenocitos y medios de células T DC-CD4+ se midieron utilizando el kit estándar Mouse IL-10 e IL-17 ELISA MAXTM (BioLegend) siguiendo las instrucciones del fabricante. Límites de detección ELISA: IL-10—31,5–2000 pg/ml, IL-17—15,6–1000 pg/ml.

Las muestras de EV y sobrenadantes se disolvieron en ditiotreitol (DTT) 10 mM, Tris 100 mM y dodecilsulfato de sodio (SDS) al 5 %, se sonicaron y se hirvieron a 95 °C durante 5 min y se precipitaron en acetona al 80 %. Los gránulos de proteína se disolvieron en urea 9 M y bicarbonato de amonio 400 mM, luego se redujeron con DTT 3 mM (a 60 °C durante 30 min), se modificaron con yodoacetamida 10 mM en bicarbonato de amonio 100 mM (a TA 30 min en la oscuridad) y se digirió en urea 2 M, bicarbonato de amonio 25 mM con tripsina modificada (Promega), durante la noche a 37 °C en una proporción de enzima a sustrato de 1:50 (M/M). Los péptidos trípticos se desalinizaron utilizando una punta de etapa C18 casera, se secaron y se volvieron a suspender en ácido fórmico al 0,1 %. Los péptidos se resolvieron mediante cromatografía de fase inversa en capilares de sílice fundida (J&W) de 0,075 × 300 mm rellenos con material de fase inversa Reprosil (Dr. Maisch GmbH, Alemania). Los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 60 min del 5 % al 28 %, un gradiente de 15 min del 28 % al 95 % y 15 min con acetonitrilo al 95 % con ácido fórmico al 0,1 % en agua a caudales de 0,15 μl/min. La espectrometría de masas se realizó con un espectrómetro de masas Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) en un modo positivo (m/z 300–1800, resolución 60 000 para MS1 y 15 000 para MS2) utilizando un escaneo de MS completo repetitivo seguido de una alta disociación inducida por colisión (HCD, a 27 energía de colisión normalizada) de los 18 iones más dominantes (> 1 carga) seleccionados de la primera exploración de MS. Se habilitó una lista de exclusión dinámica con una duración de exclusión de 20 s. Los datos de espectrometría de masas se analizaron utilizando el software MaxQuant 1.5.2.856 para la selección e identificación de picos utilizando el motor de búsqueda Andromeda, buscando contra el proteoma de Bifidobacterium longum de la base de datos Uniprot con una tolerancia de masa de 6 ppm para las masas precursoras y 20 ppm para el fragmento. iones La oxidación de la metionina y la acetilación del N-terminal de la proteína se aceptaron como modificaciones variables y el carbamidometilo de la cisteína se aceptó como una modificación estática. La longitud mínima del péptido se fijó en seis aminoácidos y se permitió un máximo de dos desdoblamientos erróneos. Los datos se cuantificaron mediante análisis sin etiquetas usando el mismo software. Las tasas de descubrimiento falso (FDR) a nivel de péptidos y proteínas se filtraron al 1% utilizando la estrategia de señuelo objetivo. Las tablas de proteínas se filtraron para eliminar las identificaciones de la base de datos inversa, los contaminantes comunes y las identificaciones de péptidos individuales57.

Para las muestras de células bacterianas, los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 180 min del 5 % al 28 %, un gradiente de 15 min del 28 % al 95 % y 25 min con acetonitrilo al 95 % con ácido fórmico al 0,1 % en agua a velocidades de flujo de 0,15 l/min. La espectrometría de masas se realizó con un espectrómetro de masas Exploris 480 (Thermo) en un modo positivo (m/z 350–1200, resolución 120 000 para MS1 y 15 000 para MS2) utilizando una exploración MS completa repetitiva seguida de disociación inducida por alta colisión (HCD, a 27 energía de colisión) de los 30 iones más dominantes (> 1 carga) seleccionados de la primera exploración de MS. Se habilitó una lista de exclusión dinámica con una duración de exclusión de 30 s. El análisis de datos de MS se realizó de manera similar a las muestras de vehículos eléctricos.

En este estudio se utilizó B. longum cepa AO44, aislado humano,16 (Brigham and Women's Hospital). El ADN genómico se extrajo utilizando el kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research). El ADN fue secuenciado por Illumina MiSeq PE 2x150 y el método de ensamblaje utilizado fue SPades v3.15.3.

El análisis de espectrometría de masas de la identificación y cuantificación del contenido de proteoma de las vesículas se realizó utilizando el software Perseus 1.6.10.43. Todos los demás análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism-GraphPad.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos analizados en este estudio están disponibles en el artículo y en su archivo de tablas complementarias. La secuencia del genoma completo de B. longum se ha depositado en GenBank, número de acceso PRJNA908295. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE, identificador de conjunto de datos PXD038667. Los datos adicionales están disponibles del autor correspondiente a petición.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Geva-Zatorsky por sus fructíferos debates y contribuciones. Un agradecimiento especial a Rachel Herren del laboratorio Geva-Zatorsky por la revisión. Agradecemos a Lihi Shaulov del equipo de BCF, la unidad de microscopio electrónico de la Facultad de Medicina de Rappaport, Technion, y a Amir Grau del equipo de Biomedical Core Facility (BCF), la unidad de citometría de flujo de la Facultad de Medicina de Rappaport, así como a como Marina Nudelman de BD Bioscience. Agradecemos al Centro de Proteómica Smoler del Technion por su ayuda con la proteómica, así como a Inna Kovrigina y a la Prof. Marcelle Machluf de la Facultad de Biotecnología e Ingeniería de Alimentos del Technion por su ayuda con NanoSight. El trabajo de crio-TEM se realizó en el Centro Technion de Microscopía Electrónica de Materia Blanda. Un agradecimiento especial a la Prof. Neta Regev-Rudzki y los Dres. Ruthie Shouval y Meirav Pevsner-Fischer del laboratorio Shouval en los Institutos Weizmann, por sus valiosas discusiones y sugerencias. Este trabajo fue apoyado por el Technion Institute of Technology, 'Keren Hanasi', Cathedra, el Rappaport Technion Integrated Cancer Center, la Alon Fellowship for Outstanding Young Researchers, la Israeli Science Foundation (subvención 1571/17 y 3165/20), el Seerave Fundación, el Premio de Desarrollo de Carrera de Investigación del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel, el Instituto Canadiense de Investigación Avanzada (CIFAR), el Premio de Desarrollo de Carrera del Programa de Ciencias Human Frontier (subvención CDA00025 / 2019-C), el premio de la fundación Gutwirth, el D. Dan y Betty Obsequio de la Fundación Kahn a la Universidad de Michigan, el Instituto Weizmann y la Colaboración para la Investigación del Technion-Israel Institute of Technology, y la Unión Europea (ERC, ExtractABact, 101078712). Sin embargo, los puntos de vista y las opiniones expresadas pertenecen únicamente al autor o autores y no reflejan necesariamente las de la Unión Europea o la Agencia Ejecutiva del Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad otorgante pueden ser considerados responsables de ellos. NGZ es miembro de CIFAR en el programa Humans & the Microbiome, miembro de Kavli y miembro de Horev (Fundación Taub). NM cuenta con el apoyo de la beca RTICC-Rubinstein. LZ es un beneficiario de JSPS Overseas Research Fellowships.

Departamento de Biología Celular y Ciencias del Cáncer, Facultad de Medicina e Instituto de Investigación Rappaport, Centro Integrado del Cáncer Rappaport Technion (RTICC), Instituto de Tecnología Technion-Israel, Haifa, 31096, Israel

Noa Mandelbaum, Shaqed Carasso, Elliot Berinstein, Tal Gefen y Naama Geva-Zatorsky

Departamento de Química y Biología Química, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Lihan Zhang y Emily P. Balskus

Centro de Proteómica Smoler, Centro Interdisciplinario Lokey de Ciencias de la Vida e Ingeniería, Instituto de Tecnología Technion-Israel, Haifa, 3200003, Israel

Tamar Ziv

Departamento de Ingeniería Química y el Instituto de Nanotecnología Russell Berrie (RBNI), Instituto de Tecnología Technion-Israel, Haifa, 3200003, Israel

Sapir Lifshiz-Simon, Irina Davidovich y Yeshayahu Talmon

Departamento de Microbiología, Inmunología y Genética de Shraga Segal, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Ben-Gurion, Beer-Sheva, 84105, Israel

Ishai Light y Tomer cocineros

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Emily P. Balskus

Los seres humanos y el microbioma, CIFAR, Toronto, Canadá

Naam Geva-Zatorsky

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Conceptualización del estudio: NM, TG y NGZ, todos los experimentos y análisis fueron realizados por NM y TG Algunos experimentos fueron realizados por LZ y EB El ensamblaje del genoma bacteriano fue realizado por SCTZ realizó todos los análisis proteómicos. Las imágenes Cryo-TEM fueron realizadas por YT, SLS e ID Parte de los experimentos de NanoSight fueron realizados por IL y TC La conceptualización de la primera parte del estudio fue realizada por EPB, LZ, NM, TG y NGZ Preparación del borrador original por NM , TG y NGZ Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Naama Geva-Zatorsky.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Mandelbaum, N., Zhang, L., Carasso, S. et al. Las vesículas extracelulares del simbionte intestinal grampositivo Bifidobacterium longum inducen efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios. npj Biofilms Microbiomes 9, 30 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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Recibido: 05 Diciembre 2022

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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